|
Реферат: Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды
Реферат: Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды
Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды культивирования устойчивой к
тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta: взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков
Особое положение тяжелых металлов (ТМ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления
организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воздействие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах
- микроводорослях и цианобактериях, которые наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных
металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах
минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные
загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).
Ванадий, как один из широко распространенных ТМ, используется зелеными, желто-зелеными и бурыми
водорослями, содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, но не является необходимым элементом для развития большинства
прокариотных микроорганизмов, среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseudomonas, а также
ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический эффект обусловлен главным образом тем, что восстанавливаясь в клетках, он стимулирует образование
свободнорадикальных состояний О2 (Popper et al., 1991).
Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-группами тиоловых соединений клеток: реакция обратима, но равновесие ее
смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчинский, 1977). Устойчивость фототрофных и других микроорганизмов к действию ТМ в наибольшей
степени обусловлена специфическим связыванием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле специализированных белков -
металлотионеинов (МТ). Общим для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп. В спектре оптического поглощения МТ в
УФ-области около 250 нм, наблюдаются типичные для металлтиолатных комплексов шиpокие полосы, которые исчезают пpи удалении металла (Ang, Wong, 1992).
Цианобактерии, культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют связывающий ионы металла МТ второго класса (Саванина и др., 1995).
В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования
бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных, богатых SH-группами белков и изменениями окислительно-восстановительного потенциала (Eh) среды.
Материалы и
методы
В работе использовали гетеротрофные бактерии, выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного
водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др., 1998). Бактерии культивировали при температуре 25-27° в конических колбах на
среде, содержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г/л (pH 7,2).
Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп
пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с использованием мембраны фирмы Serva (Германия) с
диаметром пор, пропускающих молекулы массой <10-15 кД. В присутствии ЭДТА, сульфгидрильные группы МТ и других SH-содержащих соединений освобождаются от
большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными.
Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi
(Япония), модель U-2000. Для определения концентрации ванадия в биологическом материале и культуральной жидкости использовали цветную реакцию ванадия с
4-(2-пиридилазо)-резорцином. Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной кислотой. Оптическую плотность измеряли на
том же спектрофотометре при 520 нм используя коэффициент молярной экстинкции 24500М-1см-1. Содержание диализованных
низкомолекулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию тиоловых групп в этих белках и других соединениях определяли с реактивом Элмана
(5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре
используя коэффициент молярной экстикции 11400М-1см-1. Величины pH и Eh среды култивирования измеряли на электрометре фирмы
Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer
(Голландия); для определения Eh использовали Pt-электрод, а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба электрода Российского
производства); потенциал электрода сравнения относительно нормального водородного электрода, измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979),
составляет 225±10 мВ. Таким образом, истинная величина Eh среды представляет собой сумму измеряемой величины Eh и потенциала электрода
сравнения.
Рис. 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta; 1 - контроль; 2, 3 - в
присутствии 100 и 700 мг/л ванадата соответственно.
Результаты и
их обсуждение
Клетки Ps. diminuta, изолированные из пробы придонного осадка промышленного водоема, сбросовые воды
которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг/л, хорошо растут как без ванадата, так и в его
присутствии; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x107 кл/мл среды через 12-16 суток культивирования (рис. 1). Ванадат в концентрации
700 мг/л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг/л, поскольку не
оказывая заметного влияния на рост бактерий, ванадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков.
Применение метода диализного (смешанно-раздельного) культивирования фототрофных микроорганизмов -
цианобактерий или микроводорослей с гетеротрофными бактериями рода Pseudomonas (Гусев и др., 1988) позволило выявить ряд закономерностей роста двух различных
культур, разделенных полупроницаемой мембраной. При культивировании фототрофного компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду
углеводы и гликолат. Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в качестве субстратов окисления. При этом бактерии эффективно
поглощают ванадат, существенно снижая его концентрацию в среде (Саванина и др., 1994; Гусев и др., 1997).
Рис. 2. Содержание ванадата в клетках (1) и в среде (2) в зависимости от возраста
культуры Ps. diminuta.
Действительно, как показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta, в течение первых
2 суток культивирования быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг/млн клеток, а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис. 2, кривая 1). Иная картина
наблюдается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости. За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в
среде падает от 100 до 10-12 мг/л, а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры; причем в среду возвращается до 60% ванадата (рис. 2,
кривая 2). Как видно, накопление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости: увеличение концентрации ванадата в
клетках сопровождается ее снижением в среде культивирования и наоборот.
Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный
уровень может быть обусловлено тем, что ванадат выделяется из нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл. Такими
компонентами прежде всего являются низкомолекулярные богатые SH-группами белки; могут быть и другие тиоловые соединения, к которым относятся глутатион,
цистеин, тиогликолевая кислота, дитиоэтанол, дитиопропанол и т.д.
Известно, что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в
клетках SH-содержащих белков с мол. м. до 10 кДа, связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных
белков и коррелирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под действием ванадата (Лебедева и др., 1993). Выделенный из клеток
Anacystis nidulans белок был идентифицирован как МТ II класса, связывающий ванадий (Саванина и др., 1995). Известно, что МТ большинства прокариот как
правило состоят из одной полипептидной цепи с мол. м. до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens
выделяют в среду связывающие ионы Zn полипептиды с мол. м. 1-3,5 кДа. (Appana, Whitmore, 1995). Поскольку клетки Ps. diminuta выделены из
ванадийсодержащего промышленного водоема и по данным рис. 1 устойчивы к действию ванадата, представляет интерес определение содержания
низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в динамике развития культуры.
Рис. 3. Зависимость содержания низкомолекулярных белков (1, 2) и SH-групп (3, 4) в
среде от возраста культуры Ps. diminuta. 1, 3 - контроль; 2, 4 - в присутствии 100 мг/л ванадата.
Как видно из рис. 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных
белков, содержание которых к 12 суткам составляет около 50 мкг/мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество белка к этому периоду времени возрастает до 450
мкг/мл (кривая 2). Это согласуется с ранее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др., 1993; Саванина и др., 1995) и в
клетках животных организмов (Gachot et al., 1994).
Подобным образом ванадат стимулирует накопление SH-групп низкомолекулярных белков и, возможно, других
тиолсодержащих соединений в среде культивирования Ps. diminuta (рис. 3, кривые 3 и 4); зависимости содержания SH-групп в среде от возраста культуры
имеют колоколообразный характер с максимумом, приходящимся на 8-9 сутки. Кажущееся несоответствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие
спада в содержании SH-групп, тогда как по белку такого спада нет), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом, которое должно значительно
усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действительно, в соответствии с нашими данными pH
культуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше, чем в контроле.
Рис. 4. Изменения величины Eh среды в динамике развития культуры Ps.
diminuta. 1 - контроль; 2 - в присутствии 100 мг/л ванадата.
Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps. diminuta
сопровождается сходной зависимостью снижения Eh среды. По мере развития культуры величина Eh уменьшается и достигает минимума
(180-200 мВ) к 6-8 суткам, а затем вновь возрастает (рис. 4, кривая 1). В присутствии ванадата минимальное значение Eh достигает 80 - 90 мВ
(кривая 2). Столь низкие значения Eh в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих
соединений, стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так, например, 1,4-дитиотреитол, эффективно
восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов, имеет стандартный потенциал -330 мВ при pH7; сходными окислительно-восстановительными свойствами
обладают тиогликолевая кислота, 2-меркаптоэтанол, димеркаптопропанол и др. (Досон и др., 1991).
В отличие от тиолов такие соединения, как органические кислоты, имеют стандартные редокс-потенциалы в
интервале от 50 до 250 мВ. Согласно нашим данным (рис. 5) для достижения величины Eh около 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных
условиях должно составлять несколько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при Eh около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3).
Рис. 5. Зависимость величины Eh от концентрации SH-групп цистеина,
инкубируемого в 20 мМ буфере морфолинопропансульфонате (pH 7,0).
На рис. 5 также показана зависимость величины Eh буферного раствора от концентрации SH-групп
цистеина (кривая 1). Видно, что величинам Eh около 200 и 100 мВ соответствуют концентрации SH-групп около 20 и 120 мкМ. Эти значения
согласуются с величинами Eh (рис. 4) и концентрациями SH-групп (рис. 3) в культуральной жидкости Ps. diminuta.
Таким образом, полученная корреляции между содержанием ванадата в клетках и культуральной жидкости Ps.
diminuta, накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями Eh среды культивирования бактерий позволяют полагать, что ионы ванадия, поглощенные
клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных белков, связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белками,
продуктами их деградации или с другими тиоловыми соединениями.
Список
литературы
- Веревкина
И.В., Точилкин А.И., Попова Н.А. 1977. Современные методы в биохимии, М.
- Горленко
В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. 1977. Экология водных микроорганизмов,
М.
- Гусев
М.В., Вольберг М.М., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1988. Использование
метода диализного культивирования для подбора симбиотических
альгобактериальных пар//Биол. науки, № 1, 103-106.
- Гусев
М.В., Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л. 1997. Устойчивость
культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella
maritima к токсическому действию ванадия: влияние фосфата, железа и
цистеина//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 3, 12-17.
- Досон Р.,
Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика, М.
- Лебедева
А.Ф., Саванина Я.В., Савельев И.Б. 1993. Распрeделение ванадия в клетках
цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum:
взаимосвязь с SH-содержащими низкомолекулярными белками//Вестн. МГУ. Сер.
Биология, № 4, 58-61.
- Саванина
Я.В., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1994. Смешанно-раздельное
культивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc
muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии ванадия//Вестн.
МГУ. Сер. Биология, № 2, 29-34.
- Саванина
Я.В., Адани А.Г., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б., Гусев М.В. 1995.
Образование ванадий-тионеина клетками Anacystis nidulans при
высоких концентрациях металла//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 1, 38-46.
- Саванина
Я.В., Пахомкина Б.С., Лебедева А.Ф., Дольникова Г.А. 1998.
Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans,
Anabaena variabilis и Nostoc muscorum с бактериями,
выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема. Тез. докл. на V
Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине
и экологии" Гурзуф.
- Торчинский
Ю.М. 1977. Сера в белках, М.
- Ang S.G.,
Wong V.W. 1992. Chromatographic analysis of low-molecularmass
copper-binding ligands from the crab-spesies Scylla serrata and Portunus
pelagicus//J. Chromatogr., 599, № 1-2, 21-24.
- Appana
V.D., Whitmore L. 1995. Biotransformation of zinc by Pseudomonas fluorescens//Microbios.,
82, № 332, 149-155.
- Barsky
E.L., Samuilov V.D. 1979. Blue and red shifts of bacteriochlorophyll
absorption band around 880 nm in Rhodospirillum rubrum//Biochim.
Biophys. Acta, 548, 448-457.
- Barsky
E.L., Kamilova F.D., Samuillov V.D. 1985. Do cyanobacteria contain a
membrane bound cysteine oxidase?//Z. Naturforsch, 40 c, 176-178.
- Gachot B.,
Tauc M., Wanstoc F., Morat L., Poujeol Ph. 1994. Zinc transport and
metallothionein induction in primary cultures of rabbit kidney proximal
cells//Biochem. Biophys. Acta, 1191, № 2, 291-298.
- Kagi
J.N.R. 1993. Purification and primary structure of snail metallothionein.
Similarity of the N-terminal sequence with histones H4 and H2A//Eur.
J. Biochem., 216, № 3, 739-746.
- Lowry O.,
Rosenbourg R., Farr A., Randal R. 1951. Protein measurement with Folin
phenol reagent//J. Biol. Chem., 193, 265-275.
- Nagase H.,
Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in
biological purification//Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6,
479-485.
- Obata H.,
Inoue N., Imai K., Umebauashi M. 1994. Cadmium tolerance of calli induced
from roots of plants with differences in cadmium tolerance//Soil. Sci. and
Plant. Nutr., 40, № 3, 351-354.
- Popper
H.H., Woldrich A., Grigar E. 1991. Comparison of chromate and vanadate
toxicity and its relationship to oxigen radical formation//Zentralb. Hyg.
und Umweltmed, 194, № 4, 373-379.
- Reddy
G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide:
occurence, structure, synthesis and function//Environ. Exp. Bot. 30, N 3.
251-264 Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadiums//Angev. Chem.,
103, № 2, 152-172.
|